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赛默飞大分子应用团队
全球疫情并不能停止分析科学家们技术交流与分享，6月1-12日，全球质谱界盛会—第68届美国质谱年会，在线上盛大举行。在此之前，赛默飞举办了线上预热讲座，内容涵盖LC-MS新产品，以及蛋白组学、生物制药、代谢组学等应用方向，所有内容现在仍可通过注册进行线上观看。
上一期，与大家分享了质谱新品在蛋白组学、生物制药以及临床中的应用，这一期与大家分享讲座中涉及的蛋白组学新技术与热点。
Surequant：靶标定量新方法
传统的质谱工作流程中，由于宽动态范围，血浆是最具挑战性的生物基质分析。而在传统的发现方法中，血浆中大量高丰度蛋白质的过度采样使得整体鉴定数目减少。而有针对性的工作流程可实现更高动态范围，但需要先验知识比如保留时间等，以做适当的设置。此外，这些针对性工作流程还缺乏发现方法的全面性。
图. 传统上基于质谱的血浆分析方法的局限性（点击查看大图）
该讲座中讨论了 HRAM Orbitrap 质谱的高选择性如何为靶向蛋白质组学提供一个新的方法：全新的工作流程Surequant，利用同位素标记的内标肽段实时指导内源性肽段的获取以及定量，不依赖于预设保留时间，能够实现可靠稳定的靶标定量。
01
Surequant原理
首先会进行一级全扫，然后采用inclusion list triggered MS² 来对内标肽段进行二级质谱的扫描（inclusion list中包含了所有需要检测的内标肽段），由于内标肽段通常掺入浓度较高，因此针对内标肽段的二级质谱我们会采用低分辨率（7.5K）和低离子注入时间来进行, 从而尽可能的节省扫描时间。随后将采集的内标肽段的二级质谱进行快速的在线谱图匹配，如果能匹配到目标内标肽段序列则触发一个针对内源肽段的二级质谱扫描（通过精确的mass shift来实现），而内源肽段的浓度通常较低，因此采用一个高分辨率，高离子注入时间的二级扫描来尽量提升检测的灵敏度，用于定量。
图. Surequant靶标定量方法原理（点击查看大图）
02
Surequant数据分析
因为surequant是一个全新的工作流程，所以在数据处理上有一定的挑战。SpectroDive软件可为surequant工作流程进行自动数据分析。导入surequant原始数据后，软件先校正质量轴，然后进行目标峰提取优化，之后进行基于FDR的鉴定流程，最后进行绝对定量。此外，Skyline和Proteome Discoverer 2.5也会免费开放SureQuant数据分析功能。
图. 使用SpectroDive软件分析surequant工作流程（点击查看大图）
案例一PQ500和Surequant靶标工作流程对血浆蛋白进行高度重现的绝对定量
图. 血浆蛋白Surequant定量方法工作流程（点击查看大图）
Biognosys PQ500试剂包括超过 500 个蛋白的 804 条内标IS肽段和11条iRT肽段。血浆（未去除高丰度蛋白）蛋白酶解肽段中加入PQ500试剂，使用60分钟梯度，纳升液相体系分析，进行三针重复检测，蛋白鉴定都可达到412个，并且CV值均小于20%，如下图。
图. 每个样品可鉴定到412个蛋白，动态范围覆盖6-7个数量级（点击查看大图）
案例二SureQuant 靶标工作流程对AKT和RAS 信号通路进行定量分析
对比IP富集-PRM 和 无IP富集-SureQuant方法，对三种不同癌细胞系的信号蛋白定量。以AKT/mTOR通路为例。
图. PRM和Surequant 工作流程（点击查看大图）
使用SureQuant AKT Pathway total 或 phosphor assay 试剂盒（内含经验证的抗体）进行IP 富集AKT/mTOR 通路蛋白，并进行DDA和PRM数据采集，分别在Proteome Discoverer和Skyline软件中进行分析，使用校准曲线进行 PRM 分析，结果如下所示，可在酶解产物中对每个目标肽进行绝对定量。
图. AKT/mTOR通路定量结果：IP富集-PRM方法（点击查看大图）
SureQuant方法定量分析未IP富集的酶解样品中AKT通路靶蛋白(分辨率60K/IT时间116 ms)；30分钟梯度)。每个癌细胞500ng酶解液加入50fmol IS内标肽段 (n=3)，结果如下图所示。
图. AKT/mTOR通路定量结果：SureQuant方法（点击查看大图）
△此外，可结合免疫富集与内标肽段校准曲线，可以鉴定与定量到更多低丰度靶标蛋白和翻译后修饰。△SureQuant targeted MS assays试剂盒包含经过验证的抗体、阳性对照细胞裂解物、肽段、缓冲液、仪器方法和skyline数据分析模板，为同时定量磷酸化AKT和RAS通路蛋白提供了完整的工作流程解决方案。△可结合重同位素内标肽段与EasyPep样品前处理，以及SureQuant方法，可同时定量AKT/mTOR 和 RAS/MAPK 通路蛋白。
总 结
结合PQ500试剂盒与surequant方法的完整解决方案适用于血浆蛋白组学的靶标定量！Surequant数据分析可由Proteome Discoverer 2.5或SpectroDive软件的特定工作流程完成，实现数据分析的自动化，且有利于鉴定、定量到更多的蛋白。该方法可进行高通量蛋白质靶标分析，相对于SRM、PRM，方法设置更为简单。具有高灵敏度、高精度、高准确度的特点。不依赖于保留时间的方法稳定性，基于内标肽段的无缺失值的测量准确性，一小时梯度可实现未去除高丰度血浆中500多个蛋白的靶标定量！
如果有老师对SureQuant方法感兴趣，可以联系我们合作开发SureQuant流程，建立您专属的SureQuant方法。
下一期中，我们会继续和大家分享线上预热讲座中蛋白组学新技术的精彩内容，敬请期待。
>>>>参考文献
1.ASMS2020 poster, HIGHLY REPRODUCIBLE, ABSOLUTE QUANTIFICATION OF >500 PLASMA PROTEINS WITH PQ500 AND SUREQUANT2.ASMS2020 poster, Quantitative Analysis of Ras and AKT Signaling Pathways using a SureQuantTargeted MS Workflow如需合作转载本文，请文末留言。
